Kitobni o'qish: «Руководство к практическим занятиям по биохимии. Учебное пособие для студентов специальностей «Ветеринария» и «Ветеринарно-санитарная экспертиза»»
Утверждено РИС Учёного совета Медицинского института Российского университета дружбы народов
Авторский коллектив:
Т. А. Лобаева, Е. В. Неборак, И. П. Смирнова
Рецензенты:
Смирнова Ксения Валерьевна – к.б.н., зав. лабораторией вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина" Минздрава России
Шатова Ольга Петровна – к.м.н., доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова
Предисловие
В предлагаемом читателю Руководстве авторы попытались подвести некоторые итоги опыту постановки и проведения лабораторно-практических занятий на кафедре биохимии имени академика Т. Т. Берёзова МИ РУДН для студентов 2 курса специальностей «Ветеринария» и «Ветеринарно-санитарная экспертиза».
Основной задачей занятий по биохимии по специальности «Ветеринария» на втором курсе является обучение студента чёткой формулировке цели исследования, овладению методическими приёмами исследования, проведению самого опыта. В перечень проводимых работ дополнительно включены демонстрационные работы, которые помогут студентам лучше овладеть знаниями курса биохимии, а также календарные планы практических и лекционных занятий.
Перед выполнением каждой лабораторной работы дано краткое изложение теоретических положений, подробно приводится описание хода работ в виде удобных таблиц, позволяющих легко оформить полученный результат. В конце каждого раздела имеются контрольные вопросы, целью которых является выработка у будущего специалиста самостоятельного осмысления связи между полученными данными эксперимента и установившимися теоретическими положениями.
Предлагаемые работы полностью соответствуют программе дисциплины «Биохимия» для специальности «Ветеринария» и составлены в соответствии с лекционным курсом, читаемым на кафедре биохимии им. акад. Березова Т. Т. МИ РУДН.
В указатель литературы внесены лишь названия книг, методических пособий, которые использовались ранее при составлении Руководства для выполнения практических работ на кафедре биохимии. Авторы не сочли целесообразным в настоящем Руководстве давать ссылки на оригинальные статьи, используемые в описании работ. Дополнения, как правило, вносились в связи с поставленными в опыте задачами и обозначались знаком в виде *.
Все указания и критические замечания будут приняты авторами с глубокой признательностью.
Общие правила техники безопасности в биохимической лаборатории
Важное правило для студентов:
Если вы испытываете какие-либо сомнения в методике эксперимента или в технике безопасности, прежде чем продолжить работу, проконсультируйтесь с Вашим преподавателем.
1. Приступая к выполнению практической работы, необходимо внимательно ознакомиться с инструкцией или методикой.
2. Работать в учебной биохимической лаборатории следует только в отведённое для этого время под контролем преподавателя.
3. Все манипуляции с химическими реактивами, посудой и приборами должны проводиться в спецодежде (медицинский халат, при необходимости – перчатки).
4. Во время выполнения работы следует соблюдать порядок и чистоту.
5. Следует избегать вдыхания паров или газов; никакие вещества в лаборатории нельзя пробовать на вкус, запрещается пить, принимать пищу, курить.
6. Нельзя нагревать, смешивать и взбалтывайте реактивы вблизи лица. Отверстие химического сосуда следует направлять в сторону, противоположную от лица и тела. Нельзя засасывать жидкость в пипетку ртом, необходимо пользоваться специальным приспособлением для наполнения пипеток.
7. Необходимо соблюдать особую осторожность при работе с сильными кислотами или щелочами, особенно при нагревании. Нельзя добавлять воду к концентрированным кислотам или щелочам.
8. Категорически запрещается уже отмеренные реактивы сливать (высыпать) обратно в сосуды, из которых их отмеряли.
9. Запрещается выливать в раковины концентрированные растворы щелочей и кислот, органические растворители, легковоспламеняющиеся, горючие вещества, щелочные металлы. Все указанные отходы должны обязательно собираться в специальные ёмкости.
10. Недопустимо оставлять во включенном состоянии без присмотра газовую горелку и электрические приборы.
11. О любых ситуациях, способных нанести вред здоровью, необходимо немедленно информировать преподавателя.
Список сокращений и условных обозначений
АДФ – аденозинтрифосфат
АМК – аминокислота
АМФ – аденозинмонофосфат
цАМФ – циклический АМФ
АТФ – аденозинтрифосфат
АТФаза – аденозинтрифосфата
ВЖК – высшая жирная кислота
ГАФ – глицеральдегид-3-фосфат
ГДФ – гуанозиндифосфат
ГМФ – гуанозинмонофосфат
ГТФ – гуанозинтрифосфат
ДАГ – диацилглицеролы
ДАФ – диоксиацетонфосфат
α-КГ – α-кетоглутаровая кислота
КоА – кофермент (коэнзим) А
КоQ – кофермент (коэнзим) Q
КФ – классификация ферментов
ЛП – липопротеины
ЛПВП – липопротеины высокой плотности
ЛПНП – липопротеины низкой плотности
ЛПОНП – липопротеины очень низкой плотности
МАГ – моноацилглицеролы
МАО – моноаминооксидаза
НАД+ – никотинамидадениндинуклеотид окисленный
НАДН(Н+) – никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
НАДФ+ – никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный
НАДФН(Н+) – никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
ПВК – пировиноградная кислота
ПФ – пиридоксальфосфат
СДГ – сукцинатдегидрогеназа
ТАГ – триацилглицеролы
ТХУ – трихлоруксусная кислота
УДФ – уридиндифосфат
УМФ – уридинмонофосфат
УТФ – уридинтрифосфат
ФАД – флавинадениндинуклеотид окисленный
ФАДН2 – флавинадениндинуклеотид восстановленный
ФЕП – фосфоенолпируват
ФМН – флавинаденинмононуклеотид
Фн – неорганический фосфат
ФФн – неорганический пирофосфат
ФФК – фосфофруктокиназа
ФЭК – фотоэлектроколориметр
ХЭ – холинэстераза
ЦТК – цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса)
ЩУК – щавелевоуксусная кислота
D – оптическая плотность
Dоп – оптическая плотность опытного
образца
Dст – оптическая плотность стандартного образца
Dк – оптическая плотность контрольного образца
КМ – константа Михаэлиса
Vmax – максимальная скорость реакции
Календарный план проведения лекций и практических занятий по биохимии
для студентов 2 курса по специальности «Ветеринария» и «Ветсанэкспертиза» (1 ч. лекции, 2 ч. – практические занятия)
Лекции
1 неделя. Основные классы биологических соединений. Уровни структурной организации белка. Связь структуры белков с их биологическими функциями. Простые и сложные белки.
3 неделя. Ферменты. Строение ферментов. Природа активного центра. Аллостерическая регуляция. Изоферменты. Свойства ферментов, специфичность действия. Ингибиторы ферментов. Роль коферментов в реакциях обмена веществ. Применение ферментов.
5 неделя. Гормоны. Классификация гормонов. Механизмы действия гормонов. Примеры гормональной регуляции обмена веществ.
7 неделя. Введение в обмен веществ и энергии. Обмен углеводов. Распад и синтез гликогена в печени и мышцах. Анаэробный распад углеводов: гликолиз и гликогенолиз. Энергетический эффект. Глюконеогенез.
9 неделя. Аэробный обмен углеводов. Окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты. Цикл Кребса, его энергетический эффект. Понятие о пентозофосфатном пути превращения углеводов. Регуляция углеводного обмена.
11 неделя. Обмен липидов. Классификация липидов. Значение микрофлоры рубца в переваривании липидов. Превращение глицерина и его роль. β-окисление жирных кислот. Энергетический эффект распада пальмитиновой кислоты.
13 неделя. Особенности распада жирных кислот у жвачных животных. Роль ацетил-КоА в обмене липидов. Биосинтез жирных кислот. Метаболизм кетоновых тел. «Кетозы». Роль холестерина в обмене веществ. Обмен белков. Биологическая и кормовая ценность белков.
15 неделя. Обмен простых белков. Влияние недостаточности аминокислот и белка на развитие животных. Пути превращения аминокислот. Превращения аминокислот в кишечнике, в тканях. Декарбоксилирование аминокислот. Дезаминирование аминокислот. Пути обезвреживания аммиака. Орнитиновый цикл мочевинообразования.
17 неделя. Обмен сложных белков. Обмен нуклеопротеинов. Распад и биосинтез пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов. Особенности обмена белка у птиц. Обмен хромопротеинов. Взаимосвязь обмена белков, липидов и углеводов.
Практические занятия
РАЗДЕЛ 1. ПРОСТЫЕ И СЛОЖНЫЕ БЕЛКИ. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
1 неделя. Вводная беседа. Семинар по теме: «Химия белков, аминокислоты».
2 неделя. Лабораторная работа «Цветные реакции на белки и аминокислоты». Лабораторные работы «Диализ белков», «Хроматография аминокислот». Семинар «Простые и сложные белки». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).
3 неделя. Семинар «Нуклеиновые кислоты. Структура ДНК и РНК и их биологическая роль», «Витамины». Лабораторная работа «Количественное определение витамина С в картофеле». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).
4 неделя. Семинар по теме «Ферменты, коферменты, витамины». Лабораторная работа «Действия амилазы на крахмал». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).
5 неделя. Коллоквиум 1 «Аминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты. Ферменты и витамины». Контрольная работа.
РАЗДЕЛ 2. ГОРМОНЫ. ОБМЕН УГЛЕВОДОВ
6 неделя. Семинар «Гормоны». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).
7 неделя. Семинар «Обмен углеводов. Регуляция обмена углеводов». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос). Лабораторная работа «Определение продукта ферментативного расщепления крахмала».
8 неделя. Семинар «Обмен углеводов. Пентозофосфатный путь». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).
9 неделя Семинар «Биологическое окисление». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).
10 неделя. Коллоквиум по Модулю 2 «Гормоны. Обмен углеводов». Контрольная работа.
РАЗДЕЛ 3. ОБМЕН ЛИПИДОВ. ОБМЕН ПРОСТЫХ БЕЛКОВ
11 неделя. Семинар «Обмен липидов. Регуляция липидного обмена». Лабораторная работа «Кинетика действия свиной липазы». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).
12 неделя. Семинар «Обмен липидов: распад и синтез высших жирных кислот. Расчет энергетического эффекта распада высших жирных кислот». Лабораторная работа «Определение некоторых веществ в образцах мочи человека». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).
13 неделя. Семинар «Обмен белков и аминокислот: переваривание, всасывание, пути превращения». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос). Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).
14 неделя. Семинар «Обмен белков и аминокислот: токсичность и нейтрализация аммиака в организме». Лабораторная работа «Количественное определение белка биуретовым методом. Построение калибровочных кривых». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).
15 неделя. Семинар по теме: «Обмен белков». Контрольная работа.
16 неделя. Коллоквиум по Модулю 3 «Обмен липидов. Обмен простых белков».
17 неделя. Итоговое занятие.
Правила пользования приборами для биохимических исследований
1. ФОТОМЕТР
В биохимических исследованиях фотометр используется для определения концентрации вещества в растворе по оптической плотности или коэффициенту пропускания раствора. Действие фотометра основано на том, что многие химические соединения поглощают свет в определенной спектральной области. При этом в определенных пределах концентраций величина оптической плотности раствора (то есть интенсивность поглощения света) прямо зависит от концентрации вещества в растворе. Оптическая плотность раствора определяется по формуле:
D = E l • c
D – оптическая плотность
E – коэффициент молярной экстинкции
l – толщина кюветы
c – концентрация раствора
E – коэффициент молярной экстинкции (или молярный коэффициент поглощения) – это оптическая плотность раствора концентрацией 1 моль/л при длине светового пути (толщине кюветы) равной 1 см. Величина постоянная для каждого вещества при данной длине волны.
Фотометр КФК-3–01. Общий вид
1 – ручка изменения длины волны излучения
2 – световое табло
3 – панель управления
4 – крышка кюветного отделения
5 – ручка перемещения кювет
6 – тумблер «Сеть»
Показания светового табло
7 – выбор режима измерения оптической плотности
8 – градуировка
9 – результаты измерения оптической плотности холостой пробы (воды)
10 – результаты измерения оптической плотности исследуемого раствора
11 – кювета (внешний вид)
Правила работы с прибором
1. Включите прибор в сеть. При закрытой крышке кюветного отделения включите тумблер «Сеть» (6), расположенный на боковой поверхности прибора. Тумблер загорится красным светом. В нижней половине светового табло (2) сначала появится надпись «Прогрев прибора», затем надпись «Прогрев лампы». По истечении 10 мин фотометр выдаст звуковой сигнал и на табло появится надпись «Готов к работе. Введите режим».
2. Последовательным нажатием клавиши D на панели управления (3) выберите нужный режим измерения (А – оптическая плотность), который высветится в нижней части светового табло (7).
3. Установите нужную длину волны круглой ручкой (1), находящейся слева на передней панели прибора (значение длины волны высвечивается в верхней строке светового табло). Установку длины волны необходимо выполнять подводкой со стороны коротких волн к более длинным. Если при установке значение длины волны превысило требуемое, необходимо вновь вернуться на 20–30 нм к более коротким волнам и повторно аккуратно подвести к требуемому значению длины волны.
4. Промойте водой кюветы (11) и промокните их внутреннюю поверхность чистой фильтровальной бумагой. Снаружи также протрите их фильтровальной бумагой. Откройте крышку кюветного отделения (4). Налейте в кювету воду и установите ее строго вертикально в дальнее гнездо кюветодержателя. Исследуемый раствор налейте во вторую кювету и установите ее в ближнее гнездо кюветодержателя. При установке кювет нельзя касаться их рабочих поверхностей. Наличие загрязнений на рабочих поверхностях может привести к неверным результатам.
5. Ручку перемещения кювет (5) установите в крайнее левое положение.
6. Закройте крышку кюветного отделения.
7. Нажмите клавишу «#» на панели управления. В нижней части светового табло на верхней строке появится надпись «Градуировка» (8), а через 3–5 секунд надпись «Измерение». На нижней строке появится измеренное значение оптической плотности холостой пробы (воды), например «А = 0,000» (9). Оно должно составлять 0,000±0,002. Если значение А имеет большее отклонение от нуля, необходимо повторно провести градуировку (нажать «#»).
8. Ручку перемещения кювет установите вправо до упора. Через несколько секунд на нижней строке появится значение оптической плотности исследуемого раствора, например «А = 0,230» (10). Запишите полученное значение оптической плотности в рабочую тетрадь.
9. После завершения работы выключите прибор нажатием тумблера «Сеть» и отключите прибор из сети.
2. ТЕРМОБЛОК
Термоблок предназначен для нагревания проб в пробирках и виалах в заданном температурном режиме.
ВАЖНО: прибор работает без заполнения ячеек водой. Заполнение водой опасно для жизни!
Термоблок ПЭ-4020. Общий вид.
1 – тумблер «Сеть»
2 – кнопка «Установка/работа»
3 – кнопки установки температуры
4 – ячейки для пробирок
5 – световое табло
6 – световой индикатор работы
Правила работы с прибором
1. Включите тумблер «Сеть» (1). Тумблер загорится красным светом.
2. Используя кнопки установки температуры (3) выставите на световом табло (5) требуемый температурный режим.
3. Нажмите кнопку «Установка/работа» (2). После этого начнется нагрев ячеек. Световой индикатор работы (6) станет мигать красно-зеленым цветом, а на световом табло высветится текущая температура в ячейках, которая будет постепенно увеличиваться, пока не достигнет заданного значения. После этого термоблок будет работать в режиме поддержания заданной температуры.
4. После достижения заданной температуры установите пробирки с исследуемыми растворами в ячейки термоблока (4) и оставьте их в течение необходимого срока инкубации.
5. После завершения работы выключите прибор нажатием тумблера «Сеть» и отключите прибор из сети.
Bepul matn qismi tugad.